產品簡介：

本試劑盒提供合成 cDNA 第一鏈（逆轉錄）所需要的全部試劑。其原理是用突變的莫洛尼氏鼠白血病病毒反轉錄酶（M-MuLV RT）以 RNA 為模板，高效合成 cDNA。

產品特點：

1.使用突變的反轉錄酶，內源 RNase H 活性低，使得在逆轉錄過程中 RNA 模板不容易被降解，得到的 cDNA 平均長度更長。

2.最長可合成 13 Kb 的 cDNA。

3.可以使用 oligo-dT、隨機引物和 RNA 專一性引物三種引物（前兩種本試劑盒提供）。

4.總 RNA、poly(A)+RNA 或特殊 RNA 均可作為模板。

5.得到的 cDNA 可用于后續的 cDNA 文庫構建、RT-PCR、探針標記等。

6.本產品足夠 50 次 20 ?L 體系的逆轉錄反應。

7.逆轉錄試劑盒只能用于科研。

產品參數：

產品規格

50次

運輸及保存

低溫運輸，-20℃保存，有效期一年。

自備試劑

無

使用方法：

一：合成 PCR 用的 1st-strand cDNA

1. 在一干凈的反應管中加入RNA 模板。注意：RNA 模板不能含有基因組 DNA 污

染。

RNA 模板種類加入量

總 RNA100-500 ng

或 poly(A) mRNA10-500 ng

 或專一的 RNA

2.加入引物和水

0.01 pg-500 ng

引物種類加入量

Oligo (dT)12-18，0.5 ?g/?L1 ?L

或隨機引物(6 堿基，無-修飾)，

0.2 ?g/?L1 ?L

或 RNA 模板專一性引物15-20 pmol

注意：隨機引物與 RNA 模板的比例跟 cDNA 合成的平

均長度成反比。

3.加水到 13 ?L 。

4.70℃保溫 5 分鐘后立即冰浴，此步可以打開 RNA 的二級結構。

5.再加入 5 ?L 4×RT Buffer（含 dNTP）。

6.37℃保溫 5 分鐘。對富含二級結構的高 GC RNA 模板，可以改成 45℃保溫 5 分鐘。但如果使用隨機引物，由于其很短，則改成 25℃ 5 分鐘以便其跟RNA 結合。

7.加入 1 ?L MMLV 逆轉錄酶（含 RI），反應終體積為 20 ?L。

8.42℃保溫 60 分鐘。但如果使用隨機引物，需要先 25℃保溫 10 分鐘，待合成了一段 cDNA 后，然后再轉移到 42℃保溫 60 分鐘。此步為 RT 反應。

9.70℃保溫 10 分鐘以終止反應，然后放置在冰上待用。合成的 cDNA 可以直接作為PCR 模板使用，不需要純化。

二：合成建文庫用的 1st-strand cDNA

1.在一干凈的反應管中加入RNA 模板。注意：RNA 模板不能含有基因組 DNA 污染。

2.加入引物

引物種類加入量

Oligo (dT)12-18，0.5 ?g/?L1 ?L

或隨機引物(6 堿基，無-修飾)

0.2 ?g/?L1 ?L

或 RNA 模板專一性引物100 pmol

注意：隨機引物與 RNA 模板的比例跟 cDNA 合成的平均長度成反比。

3.加水到 13 ?L。

4.70℃保溫 5 分鐘后立即冰浴，此步可以打開 RNA 的二級結構。

5.再加入 5 ?L 4×RT Buffer（含 dNTP）。

6.37℃保溫 5 分鐘。對富含二級結構的高 GC RNA 模板，可以改成 45℃保溫 5

分鐘。如果使用隨機引物，則改成 25℃ 5 分鐘。

7.加入 2 ?L MMLV 逆轉錄酶（含 RI），反應終體積為 20 ?L。

8.42℃保溫 60 分鐘，但如果使用隨機引物，需要先 25℃保溫 10 分鐘，然后再轉移到 42℃保溫 60 分鐘。此步為 RT 反應。

9.70℃保溫 10 分鐘以終止反應，放置在冰上待用。合成的 cDNA 可以用于第二鏈 cDNA 的合成或放置在-20℃長期保存。

選擇我們的逆轉錄試劑盒，就是選擇精準、高效、可靠的檢測方案，為您的科研實驗保駕護航！