產(chǎn)品簡介：

本產(chǎn)品是 4×LAMP MasterMix（可視化染料-熒光染料法）和免提取樣本 DNA 釋放劑的組合。前者含有可視化 LAMP 擴增所需的所有成分，可以用于可視化 LAMP 和熒光染料雙染料等溫擴增。免提取樣本 DNA 釋放劑可用于處理各種樣品，直接不經(jīng)過提取直接用于PCR 或 LAMP 擴增。

產(chǎn)品特點：

1.即開即用，用戶不需要單獨準(zhǔn)備每個成分。

2.不需要單獨進行核酸純化，LAMP 擴增后可以直接肉眼觀察，不需任何設(shè)備。也可以在熒光定量 PCR 儀器上擴增并進行實時結(jié)果觀察。

3.高特異性，精心優(yōu)化的可視化染料-熒光染料雙染料 LAMP MasterMix 配方，非特異擴增比自配的 LAMP 試劑更低。

4.4×MasterMix，比對應(yīng)的 2×MasterMix 能使用能多的擴增模板。如果樣品沒有抑制物，最多可使用 14 ?L 釋放液進行擴增，降低漏檢的機率。

5.高擴增效率，一般比 PCR 靈敏一個數(shù)量級。

6.本試劑盒足夠 50 次免提取樣本處理和 50 次 20 mL 體系的雙染料 LAMP 擴增。

7.提供擴增對照，便于在遇到困難時分析原因。

8.免提取 LAMP 試劑盒只能用于科研，不能用于臨床。

產(chǎn)品參數(shù)：

產(chǎn)品規(guī)格

50次

保存和運輸

第 1 部分常溫運輸和保存，第 2 部分低溫運輸，-20℃保存。有效期一年。

自備試劑

20×免提取 LAMP 引物混合液（靶分子專一）

使用方法：

一、樣品 DNA 的制備

1.打開金屬浴或PCR 儀，把溫度調(diào)到 95℃。

2.配制 1 mL 工作液（足夠 10 個樣品，如果樣品不止 10 個，需要按比例增加）： 在一干凈的1.5 mL自備塑料離心管中加入10 ?L免提取模板制備溶液A 成分1， 20 ?L 免提取模板制備溶液A 成分 2 和 970 ?L 超純水，充分混合均勻待用。溶液 A 工作液可室溫放置，但最好在一周內(nèi)用完。

3.標(biāo)記 10 個PCR 管（方便后續(xù)用 PCR 儀加熱保溫），分別加入 100 ?L 上步所配制的溶液 A 工作液。

4.如果是固體樣品，需要確保固體樣品被溶液 A 工作液淹埋，如果是液體樣品則震蕩混勻即可。動物組織 1-5 mg、鼠尾 2 mm、血液樣品不超過 20 mL、植物葉片 1-5 mg、植物種子 1-5 mg、0.2-0.5 ?L 微生物培養(yǎng)物離心所得的沉淀、血清血漿等蛋白濃度高的液體樣品 10-30 ?L、其他液體樣品（如保存液中的病毒樣品）50-100 ?L。對上表未列出的樣品，用戶需要自己摸索最佳用量。對富含多醌多酚的植物材料（如棉花），使用量最好不要超過 0.5 mg。

5.在金屬浴或 PCR 儀上 95℃保溫 10 分鐘。

6.待冷卻到常溫。

7.每個管中加入 10 ?L 溶液 B 并輕柔吹打混勻得 DNA 釋放液。這些 DNA 釋放液可以直接使用，每次用 1-14 ?L，足夠進行 50-100 次PCR 或 LAMP 擴增。

二、LAMP 反應(yīng)（20 μL 體系）

8.反應(yīng)設(shè)置：第一次使用時請把所有 Bst DNA 聚合酶 2.0（50 μL，本試劑盒提供）加入到 4×LAMP MasterMix（雙染料法，待加酶）中，輕柔顛倒 20 次充分混勻，然后再取用。如果有 N+2 個 DNA 純化樣品，則最好設(shè)置 N+4 個 LAMP 擴增，增加 LAMP 擴增陽性對照和 LAMP 擴增陰性對照各 1 個。在 N+4 個 PCR 管中加入下列成分：

9.如果使用金屬浴或水浴保溫，沒有熱蓋，則每個反應(yīng)管中加入 50 μL 自備的 PCR

級石蠟油，否則保溫期間反應(yīng)體系的水分會蒸發(fā)到管蓋下方凝集，反應(yīng)體積變化， 會嚴(yán)重影響反應(yīng)效率，增加假陽性率。最后置于 65℃保溫 60 分鐘進行擴增。

10.如果使用常規(guī)PCR 儀進行 LAMP 反應(yīng)，設(shè)置程序時必須打開熱蓋，設(shè)置成 65℃ 保溫 60 分鐘進行擴增。

11.如果使用熒光定量 PCR 儀，則設(shè)置 60 次循環(huán)，每次 65℃保溫 1 分鐘，采集

SYBR 通道的熒光信號。三、結(jié)果分析

12.電泳分析：由于取樣時非常容易產(chǎn)生氣溶膠污染，污染實驗環(huán)境并且非常難清除

污染，所以強烈建議不要采取此方法分析實驗結(jié)果。即使使用，也要在不同的房間，使用不同的移液槍操作。具體做法是取 10 μL LAMP 擴增產(chǎn)物跟自備上樣液混合后進行2%瓊脂糖凝膠電泳。LAMP 陽性對照必須有正常LAMP 條帶（200 bp 左右的梯形擴增產(chǎn)物），LAMP 陰性結(jié)果必須無條帶，否則實驗結(jié)果無效。如果 LAMP 陽性對照和陰性對照結(jié)果正常，再分析待測樣品。典型的電泳結(jié)果見下表，奇數(shù)樣為陰性結(jié)果，偶數(shù)樣為陽性結(jié)果：

13.可見光（肉眼）分析：樣品制備陽性對照和 LAMP 陽性對照的反應(yīng)液將呈藍(lán)色， 樣品制備陽性對照和 LAMP 陰性對照的反應(yīng)液將呈淡藍(lán)色或無色，否則提取實驗或擴增實驗無效。如陽性和陰性對照結(jié)果正常，則實驗有效，可以分析樣品的情況。樣品管的顏色接近擴增陽性對照管則說明樣品為陽性，如接近陰性對照則說明待測樣品為陰性。典型的可將光檢測結(jié)果見左圖（9 為陰性、10 為陽性）。

14.熒光分析（僅限于用 qPCR 儀進行反應(yīng)的場景）：樣品制備陽性對照和 LAMP 陽性對照的反應(yīng)液將有標(biāo)準(zhǔn)的 S 擴增曲線，樣品制備陰性對照和 LAMP 陰性對照的反應(yīng)液將沒呈平線，沒有 S 曲線，否則提取實驗或擴增實驗無效。如果陽性和陰性對照結(jié)果正常，則實驗有效，可以分析樣品的情況。樣品管的熒光曲線為

S 型，則說明樣品為陽性，如果為平線則說明待測樣品為陰性。典型的熒光檢測結(jié)果見下圖。左邊為陽性，右邊為陰性。

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