產品簡介：

DNA 甲基化分析中的關鍵步驟是亞硫酸氫鹽修飾 DNA，此反應要求 DNA 必須處于單鏈狀態，反應還必須在低溫進行。由于常規的修飾反應都在液相進行，在低溫下讓液相中的 DNA 保持單鏈狀態非常棘手，故修飾效率很低。此外，修飾反應要多次切換反應液， 有多個沉淀步驟，故 DNA 回收率一般都不高于 50%。為克服這些缺點，本公司開發出了此產品。

產品特點：

1.用包埋的 DNA 進行所有操作，免去所有沉淀和純化步驟，極大簡化了操作。

2.免去了 DNA 提取過程，所需實驗材料更少，最少幾個細胞都可以，極大地節約了寶貴材料，尤其適用于珍-稀材料。

3.包埋中的 DNA 在整個操作過程中都處于單鏈狀態，提高了修飾效率。

4.DNA 包埋在包埋塊中，切換反應液不但非常方便，而且 DNA 回收率都在 90%以上。

5.既適用于實體材料和懸浮細胞，也適用于純化好的 DNA 樣品。

6.DNA 甲基化修飾試劑盒（凝膠法）足夠制備 150 多個 10uL 包埋塊（如果用純化好的 DNA）或 25 個 10uL 包埋塊（如果用懸浮細胞）。

產品參數：

產品規格

保存和運輸

常溫運輸及保存。蛋白酶 K 溶液（10mg/mL）、包埋液、包埋塊裂解液需低溫運輸，

-20℃保存。有效期一年。

自備試劑

超純水

使用方法：

一、準備試劑

1.在裝有 2.3g 天凈沙甲基化修飾溶液B 成分一干粉的棕色瓶中加入 3.9 mL 水和 0.9 mL 天凈沙甲基化修飾溶液 A，搖晃溶解得到 4.8 mL 溶液 B 成分一。

2.在裝有 110mg 溶液 B 成分二干粉的離心管中加入 1 mL 50℃預熱的超純水，搖晃溶解，得到溶液 B 成分二。

3.將 0.6 mL 溶液 B 成分二加入到 4.8 mL 溶液 B 成分一中，得到 5.4 mL 溶液 B 工作液，冰上放置待用。未用完的溶液 B 工作液不得再使用。

4.每次實驗前，將裝有 1.5 mL 包埋液的離心管在沸水浴上放置數分鐘直到變成溶液， 然后放 80℃待用。

二、對微量組織材料（如果材料足夠，可先純化 DNA，再直接進入第三步）

5.用常規的胰-酶消化法處理動物實體組織或培養細胞，得到濃度不超過 60 個細胞/uL 的單細胞 PBS 懸液。如果實驗材料已經是單細胞懸浮液（如卵細胞），則 PBS 洗滌后直接離心沉淀，再重懸在 PBS 中（濃度不超過 60 個細胞/uL）。注：本試劑盒不含本步所需相關試劑，如胰-酶消化液和 PBS。

6.在一個自備的 2 mL 離心管中加入 3 uL 上步所得細胞懸液，再迅速滴加 7 uL 在80℃預熱的包埋液，共得 10uL 包埋液-細胞混合液。注：不需要吹打混勻以免混合液在搶頭里面凝固。

7.加入 500 uL 分子生物學級石蠟油確保后續處理過程中溶液不會蒸發。短暫離心確保10uL 包埋液-細胞混合液沉到管底。

8.將離心管在沸冰浴中放 20 分，此步可將 DNA 分子變性成單鏈。

9.將離心管轉移到冰上放置 30 分鐘，包埋液-細胞混合液將凝固成 10uL 的包埋塊， 包埋塊中將包含細胞的基因組 DNA 和蛋白質組份。

10.在包埋塊中加入 500 uL 包埋塊裂解液和 5 uL 蛋白酶 K 溶液（10mg/mL），短暫離心后 37℃保溫過夜。此步將降解包埋塊中的蛋白質組份。

11.吸棄包埋塊之外的所有溶液（包括石蠟油）后，分別用 1mL TE 緩沖液室溫浸泡包埋塊 2 次，每次 15 分鐘。此步可去除殘留在包埋塊中的裂解液和蛋白酶 K。

12.酶切包埋塊中的基因組 DNA：選定不識別 PCR 靶片段的內切酶（本試劑不提供該試劑），再用此酶對應的 100 uL 1×酶切緩沖室溫液浸泡包埋塊 15 分鐘，吸棄該緩沖液后再加入 100 uL1×酶切緩沖和 50U 選的的內切酶，37℃保溫 2 小時后吸棄內切酶反應液。

13.加入 500uL 新鮮配制的處理液 A，室溫放置 15 分鐘后吸棄處理液 A。處理液 A 配制方法：100 uL DNA 甲基化修飾溶液 A +400 uL 超純水。

14.重復上步一次。此時 DNA 將呈單鏈。

15.加入 1 mL 新鮮配制的處理液 B（不是溶液 B），室溫浸泡包埋塊 5 分鐘后吸棄處理液 B。處理液 B 配制方法：50uL DNA 甲基化修飾溶液 A +950 uL 超純水。

16.加入 750uL 石蠟油，然后沸水浴 30 秒，使 DNA 變性。

17.將離心管轉移到冰上放置 30 分鐘使包埋塊重新凝固，單鏈 DNA 將固化。

18.在離心管中加入 1mL 在第 3 步預冷的溶液 B 工作液，短暫離心后繼續在冰上放置30 分鐘。此步用于修飾固化的單鏈 DNA。

19.將離心管轉移到 50℃放置 3.5 小時后吸棄溶液 B 工作液。

20.分別用 1mL TE 緩沖液常溫洗滌包埋塊 2 次，每次 15 分鐘，吸棄 TE 緩沖液。

21.分別用 500 uL 新鮮配制的處理液 C（50 uL DNA 甲基化修飾溶液 A +450 uL 超純水）常溫洗滌包埋塊 2 次，每次 15 分鐘，然后吸棄處理液 C。

22.用 1 mL TE 緩沖液常溫洗滌包埋塊 3 次，每次 10 分鐘，然后吸棄 TE 緩沖液。

23.所得包埋塊可以在 4℃保存數月待用，也可以用超純水洗滌兩次（每次 15 分鐘）后直接用做 100uL 體系甲基化 PCR 的模板。

三、對純化好的DNA 溶液

24.如果樣本是純化好的 DNA 溶液，先用不識別 PCR 靶片段的合適內切酶酶切 DNA， 總體積不超過 20uL，DNA 不超過 700 ng。本試劑盒不提供所需內切酶。

25.酶切結束后，沸水浴 10 分鐘滅活內切酶并變性 DNA。

26.冰上放置并短暫離心數秒后，再加入 4 uL DNA 甲基化修飾溶液 A，50℃保溫 15 分鐘。

27.迅速加入 50 uL 在 80℃預熱的包埋液，用手指快速彈擊管底混勻溶液并繼續放 80℃ 待用。不要吹打混勻以避免包埋液在移液槍頭中凝固。

28.在一個新的 2 mL 離心管中，加入1 mL 第 3 步預冷的溶液B 工作液，再加上 750 uL 石蠟油，短暫離心后將離心管放冰上預冷。

29.迅速取 80℃保溫的混合液 10uL（第 27 步），用在空中滴加的方式加到第 28 步準備的預冷離心管中，滴加的混合液遇冷將迅速在石蠟油中形成一個包埋塊。注意：  不要將槍頭浸入到預冷的溶液中，否則包埋液將迅速在槍頭內凝固。如果包埋塊沒  有沉到管底，可以用槍頭將其撥到石蠟層下面的液相中。

30.再重復上步操作 6 次，共可以得到 7 個包埋塊（每塊約含 100ng DNA）。

31.將離心管（含 7 個包埋塊）繼續放冰上 30 分鐘進行修飾。

32.后續操作同第 19-23 步。

選擇我們的DNA 甲基化修飾試劑盒（凝膠法），就是選擇精準、高效、可靠的檢測方案，為您的科研實驗保駕護航！