產品簡介：

市場上的基于堿變性法的質粒提取試劑盒都是為提取大腸桿菌質粒 DNA 的提取而開發的，本試劑盒是以堿變性法為基礎、專門為農桿菌質粒 DNA 提取而開發的。其過程是首先菌體經離心懸浮后，被 SDS 和堿裂解，并且堿使基因組 DNA 和質粒 DNA 變性，隨后用酸中和，質粒 DNA 可以快速復性，而基因組 DNA 不能快速復性，故可以通過離心去除。

產品特點：

1.專門為農桿菌質粒提取優化，不適用于非農桿菌。

2.適用于常見的穿梭質粒和雙元質粒，不適用于 pTi 或 pRi 等大型質粒，提取這些質粒DNA 需另購本公司專門的相關產品。

3.快速、步驟少，整個操作在 40 分鐘左右完成。

4.溶液 B 中有藍色染料，便于目測非常關鍵的堿變性和中和反應兩步的溶液混勻狀況， 保證實驗效果。

5.產量高，每毫升過夜培養的菌液可以提取到 2-5 μg/mL（取決于質粒是高拷貝、中拷貝還是低拷貝）。

6.本產品足夠 50 次微量提取，一次可以處理 4-5 mL 過夜培養的菌液。

7.純度高，采用本試劑盒提取的質粒 A260/A280 在 1.8-2.0 之間，可以直接用于酶切、轉化、測序及PCR 等。

8.農桿菌質粒 DNA 純化試劑盒（沉淀法）只能用于科研。

產品參數：

規格及成分

保存和運輸

常溫運輸和保存，RNase A 溶液需要-20℃保存低溫運輸，有效期一年。

自備試劑

蒸餾水、75%乙醇

使用方法：

1.     實驗前將農桿菌質粒DNA 純化溶液 A（下面簡稱溶液 A）和農桿菌質粒 DNA 純化溶液 C（下面簡稱溶液 C）放冰上預冷。第一次使用時把本試劑盒提供的細菌裂解增效劑全部加入到溶液A 中，輕柔混勻后待用。

2.從篩選平板上挑取農桿菌單菌落至含抗生素的培養基中，28℃震蕩培養 12-16 小時（搖床轉速 200-300×g），使其 OD600 達到 1.0-1.2（剛進入平臺期）。注意：建議使用 YEP 培養基，營養更豐富的培養基會使菌體濃度過高，超過純化系統的處理能力而降低質粒 DNA 的質量。另外，延長培養時間會因細胞死亡、裂解而造成質粒DNA 濃度降低。

3.用 1.5 mL 離心管收集 1.5 mL 過夜培養飽和菌液，4℃ 14,000×g 離心 1 分鐘，棄上清，再短暫離心，吸棄殘留液體。

4.再加入 1.5 mL 過夜培養飽和菌液，4℃ 14,000×g 離心 1 分鐘，棄上清，再短暫離心，吸棄殘留液體。

5.可以重復上步操作，直到累計得到 4-5 mL 菌液沉淀。

6.用 1 mL 自備的蒸餾水重懸細菌沉淀，14,000×g 離心 1 分鐘后棄上清。

7.在沉淀中加入 150 uL 冰上預冷的溶液 A，用槍頭充分吹打或漩渦振蕩使菌體充分重懸。如果細胞未充分懸浮將會嚴重影響后續堿變性，降低質粒 DNA 回收率。

8.室溫放置 5 分鐘。

9.加入 300 uL 農桿菌質粒DNA 純化溶液 B（下面簡稱溶液B，如果溶液B 在低溫放置產生沉淀，須 37℃加熱溶解后冷卻到室溫方可使用。溶液 B 用后需要將蓋擰緊存放，否則空氣中的二氧化碳會進入溶液，形成碳酸，中和溶液 B 中的堿，降低其效率。如果溶液 B 顏色不是藍色，則表示變質，應該棄之不用并且跟廠家聯系），溶液將變得粘稠。

10.溫和顛倒混勻 5-6 次（根據藍色的均勻程度判斷）后在冰上準確放置 10 分鐘。注意： 此步不要劇烈振蕩，冰上放置時間也不要超過 10 分鐘。

11.加入 250 uL 冰上預冷的溶液 C，溫和反復顛倒 4-6 次，溶液將變成無色，并有白色絮狀沉淀產生。

12.冰上放置至少 10 分鐘讓質粒 DNA 復性。不能短于 10 分鐘。

13.4℃ 14,000×g 離心 10 分鐘，小心將上清液（只取 600 uL）轉移到一個新離心管中。此時的溶液比重較大，部分絮狀物懸浮在上清液中屬正常現象，吸取上清時避開這些懸浮物即可。

14.加入 10 uL 本試劑盒提供的RNase A 溶液（10 mg/mL），室溫放置 20 分鐘。

15.加入 600 uL 質粒去蛋白溶液，渦旋震蕩器上充分震蕩 2 分鐘。

16.4℃ 14,000×g 離心 2 分鐘，將水相（無色部分）轉移到一個新的離心管中，不要取有顏色的相。

17.加等體積的核酸沉淀劑 B 型，顛倒 30 秒混勻后 4℃ 14,000×g 離心 15 分鐘，質粒DNA 將形成沉淀，棄上清。

18.加入 1 mL 的自備 75%乙醇，室溫 14,000×g 離心 1 分鐘，棄上清。

19.室溫 14,000×g 離心半分鐘，用移液槍小心取出殘留液體（約 50 uL）。

20.室溫短暫放置半分鐘。

21.加入 50-100 uL DNA 洗脫液（基因組 DNA 專用）重懸沉淀，即得質粒 DNA 溶液。可以直接用于后續實驗。

選擇我們的農桿菌質粒 DNA 純化試劑盒（沉淀法），就是選擇精準、高效、可靠的檢測方案，為您的科研實驗保駕護航！