產品簡介：

隨機引物凍干粉（10 堿基、無-修飾）是 10 堿基、無-修飾隨機引物的干粉，用于逆轉錄反應和隨機引物標記。本產品只能用于科研，不能用于臨床。

產品參數(shù)：

規(guī)格及成分

保存和運輸

常溫運輸，低溫保存，有效期一年。

自備試劑

超純水。

使用方法：

一、逆轉錄反應

1.在隨機引物 (10 堿基，無-修飾) 干粉管中加入 25 uL 自備的超純水，渦旋震蕩半分鐘混勻，得到 0.2 ug/uL 的 10 堿基隨機引物溶液（ -20℃保存，下同）。

2.在一干凈的反應管中加入自備的 RNA 模板。注意：RNA 模板不能含有基因組DNA 污染。

RNA 模板種類加入量

總 RNA100-500 ng

或 poly(A) mRNA10-500 ng

或專一的 RNA0.01 pg-500 ng

3.加入引物和水

4.加水到 13 uL。

5.70℃保溫 5 分鐘后立即冰浴，此步可以打開 RNA 的二級結構。

6.再加入 5 uL 4×RT Buffer（含 dNTP）。

7.37℃保溫 5 分鐘。對富含二級結構的高 GC RNA 模板，可以改成 45℃保溫 5 分鐘。但如果使用隨機引物，由于其很短，則改成 25℃ 5 分鐘以便其跟RNA 結合。

8.加入 1 uL MMLV 逆轉錄酶（含 RI），反應終體積為 20 uL。

9.42℃保溫 60 分鐘。但如果使用隨機引物，需要先 25℃保溫 10 分鐘，待合成了一段 cDNA 后，然后再轉移到 42℃保溫 60 分鐘。此步為 RT 反應。

10.70℃保溫 10 分鐘以終止反應，然后放置在冰上待用。合成的 cDNA 可以直接作為PCR 模板使用，不需要純化。

二、隨機引物標記

11.需要在隨機引物 (10 堿基，無-修飾) 干粉管中加入 12.5 ?L 自備超純水，渦旋震蕩 30 秒，短暫離心 10 秒。得到 0.4 ug/uL 的 10 堿基隨機引物溶液，放冰上待用。

12.在一干凈的塑料離心管中加入下列成分：

成分用量

模板 DNA

（PCR 回收片段，長度 100-1000 bp）50-150 ng

5×隨機引物地高-辛標記反應液4 uL

0.4 ?g/uL 的 10 堿基隨機引物溶液4 uL

超純水補水到 19 uL

13.PCR 儀上 100℃加熱 10 分鐘使模板 DNA 徹-底變性。

14.立即放冰上待用。不能緩慢降溫，否則變性的模板DNA 單鏈又會雜交形成雙鏈。

15.離心數(shù)秒使所有液體集中在管底。

16.加入 1 uL Klenow exo DNA 聚合酶，輕柔吹打混勻。此時反應總體積為 20uL。

17.37℃保溫 1-20 小時。標記效率跟模板 DNA 和保溫時間相關，模板越多，新合成探針多，但新合成探針/模板比例低，雜交信號低。模板越少，新合成探針少，但探針/模板比例高，雜交信號高。但探針少到一定程度，也不會有雜交反應發(fā)生。因此用戶需要探針合成量和雜交信號強弱在這兩者之間進行折衷選擇。

18.反應結束后加熱 100℃ 5 分鐘使 DNA 聚合酶變性，同時使 DNA 探針變性成單鏈。變性后的標記反應液可以放-20℃長期保存，也可以直接將變性后的探針加入到雜交反應液中進行雜交。如果電泳檢測，標記產物將是彌散狀態(tài)。

隨機引物凍干粉（6 堿基、無-修飾）

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