產品簡介：

辣椒輕斑駁病毒（Pepper Mild Mottle Virus，PMMoV）是一種影響辣椒作物的植物病原性病毒，屬于煙草花葉病毒科。該病毒是一種單鏈正義 RNA 病毒，基因長度約為 6.4 knt。這種病毒在全球范圍內對甜椒、辣椒和觀賞辣椒品種構成嚴重威脅，導致產量和品質下降。辣椒輕斑駁病毒的典型癥狀包括葉片褪綠、發育不良、果實結構扭曲和塊狀。其傳播途徑主要包括機械傳播和通過受感染的種子傳播。由于該病毒一旦感染植物就無法治療，因此控制這種疾病的最好方法是使用經過病原體檢測和處理的種子進行種植。因此快速靈敏診斷辣椒輕斑駁病毒具有重要意義。本產品就是以探針法熒光定量 RT-PCR 技術為基礎開發的專門檢測辣椒輕斑駁病毒的含內參試劑盒。

產品特點：

1.即開即用，用戶只需要提供樣品 RNA 模板。

2.引物和探針經過優化，分析靈敏度高，可以達到 100 拷貝/反應。

3.提供陽性對照，便于制備標準曲線和用作擴增對照，排除假陰性結果。

4.含識別內源性內參的引物和探針，便于排除 RT-PCR 假陰性樣本。

5.特異性高，靶分子的引物和探針是根據辣椒輕斑駁病毒 RNA 高度保守區設計，不會跟其他生物的 RNA 發生交叉反應。

6.既可用于定性檢測，又可用于定量檢測。定量檢測時線性范圍至少為 5 個數量級。

7.本產品足夠 50 次 20 μL 體系的探針法 RT-PCR 反應。

8.辣椒輕斑駁病毒探針法 qRT-PCR 試劑盒只能用于科研。

產品參數：

產品規格

50T/盒，可滿足一定規模的檢測需求。

檢測方法

實時熒光PCR，具有快速、準確、靈敏等優點。

試劑盒成分

探針法 qRT-PCR 緩沖液、探針法 qRT-PCR酶混合液 v2、熒光 PCR 專用模板稀釋液、辣椒輕斑駁病毒 qRT-PCR探針法引物-探針干粉、辣椒輕斑駁病毒 qRT-PCR陽性對照(1×10E7 拷貝/μL)、使用手冊。

自備試劑

樣品 RNA，超純水，核酸純化試劑盒。

保存和運輸

低溫運輸，-20℃保存，保存期限為 24 個月。

使用方法：

一、稀釋標準曲線樣品（以陽性對照 1E1-1E6 拷貝/μL 這 6 個 10 倍稀釋度為例）。

1.標記 6 個離心管，分別為 6、5、4、3、2、1。

2.在各管中加入 45 μL 熒光PCR 專用模板稀釋液。

3.在 6 號管中加入 5 μL 1E7 拷貝/μL 的陽性對照(試劑盒提供)，充分震蕩 1 分鐘，得 1E6 拷貝/μL 的標準曲線樣品。放冰上待用。

4.換槍頭，在 5 號管中加入 5 μL 1E6 拷貝/μL 的陽性對照(上步稀釋所得)，充分震蕩 1 分鐘，得 1E5 拷貝/μL 的標準曲線樣品。放冰上待用。

5.換槍頭，在 4 號管中加入 5 μL 1E5 拷貝/μL 的陽性對照(上步稀釋所得)，充分震蕩 1 分鐘，得 1E4 拷貝/μL 的標準曲線樣品。放冰上待用。

6.重復上面的操作直到得到 6 個稀釋度的標準曲線陽性樣品。放冰上待用。

二、樣品 RNA 的制備

7.如果有 N 個樣品，最好設置 N+2 個提取，多出的一個是制備 PC（樣品制備陽性

對照），一個是制備 NC（樣品制備陰性對照）。可以用確認是陽性的樣本作為陽性對照，用確認是陰性的樣本作為陰性對照。

8.用自選方法純化樣品的 RNA，本試劑盒跟市場上大多數 RNA -提取試劑盒兼容， 也可以選購本公司的核酸-提取試劑。

三、Probe qRT-PCR 反應（20 μL 體系，在樣品制備室進行）

9.如果做定量分析并且只做 1 次重復，則標記 N+9 個PCR 管，其中 N+2 個用于上步得到的 N+2 個樣品，1 個用于 RT-PCR 陰性對照（用水做模板），6 個用于標準曲線。如果做定性分析并且只做 1 次重復，則標記 N+4 個 RT-PCR 管，其中N+2 個用于上步得到的 N+2 個樣品，1 個用于 RT-PCR 陰性對照（用水做模板）， 1 個用于 RT-PCR 陽性對照（直接用第 6 步第 4 號管的陽性對照稀釋液做模板）。下面只以定量分析為例描述操作步驟。

10.在標記管中按下表加入各成分（本表只列出一次重復）：

成分樣品管

N+2 個RT-PCR

陰性對照標準曲線樣品管

（1-6 管）

探針法 qRT-PCR 緩沖液各 10 μL10 μL各 10 μL

探針法 qRT-PCR 酶混合液 v2各 1 μL1 μL各 1 μL

辣椒輕斑駁病毒 PCR 引物-探針

混合液(含內參引物和探針)各 4 μL4 μL4 μL

N+2 個待測樣（含內源性內參）各 5 μL不加不加

超純水不加5 μL不加

第 6 步所得標準曲線樣品稀釋液

（含內參，1-6 號）不加不加各 5 μL（2 號樣

到 2 號管，3 號樣

到 3 號管…）

四、數據處理

12.陰性陽性判斷：沒有 Ct 讀數，或 Ct 大于 40 判為陰性結果。有 Ct 讀數，Ct 值小于 40，熒光信號有對數增長，有典型擴增曲線判為陽性結果。每個樣本需要對FAM 通道和 Cy5 通道的結果分別進行判定，得到兩個結果。

13.實驗有效性判斷：如果擴增陽性對照或制備陽性對照 FAM 通道結果為陰性則整個實驗無效，不需要分析數據，需要分析原因，可能是操作、儀器和試劑三方面的原因，重做擴增或制備或跟儀器和試劑廠家聯系。如果擴增陰性對照或制備陰性對照 FAM 通道結果為陽性，說明環境污染，則整個實驗無效，不需要分析數據，需要分析失敗原因，直到污染消除。如果陽性對照和陰性對照正常，則進入下一步分析樣本的有效性。

14.樣本有效性判斷：如果樣本 FAM 通道的結果為陽性，則無論內參通道的結果是陰性還是陽性，樣本的結果均有效。如果樣本結果為陰性，內參通道結果也為陰性， 則此樣品的陰性結果無效。此樣品需要重新提取核酸和進行擴增。

15.如果把本試劑盒用于定量檢測，則以陽性對照濃度的 log 值為橫軸，分別以陽性對照 FAM 通道和內參通道的 Ct 值為縱軸，繪制標準曲線，陽性對照 FAM 通道讀數的標準曲線為斜線，r2 必須大于 0.95，內參通道讀數的標準曲線為一條跟 X 軸平行的橫線。再以待測樣品的 Ct 值從陽性對照FAM 通道讀數的標準曲線上推算出樣品 RNA 濃度的 log 值，再推算出其濃度。

16.如果用于定性實驗，對待測樣品，如果其 FAM 通道的 Ct 沒有讀數、或 Ct 大于或等于 40 則均為陰性，如果小于 40 則為陽性。對任何 FAM 通道結果為陰性的待測樣本，如果其對應的內參通道也為陰性，則此樣品的陰性結果無效，此樣品需要重復實驗。

選擇我們的辣椒輕斑駁病毒探針法 qRT-PCR 試劑盒，就是選擇精準、高效、可靠的檢測方案，為您的科研實驗保駕護航！